nsu_icbfm_aakechin_202206.pdf

• Кечин Андрей Андреевич, к.б.н., руководитель работы, НГУ, старший преподаватель ФЕН и ИМПЗ (по совместительству); ИХБФМ СО РАН, научный сотрудник Лаборатории фармакогеномики
• Боробова Виктория Сергеевна, студент ФЕН НГУ, 2-й курс магистратуры, кафедра молекулярной биологии и биотехнологии,

Одним из применений массового параллельного секвенирования (NGS) является поиск патогенных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у пациенток с диагнозом «рак яичников» при помощи таргетного секвенирования. Особенностью этих генов является высокая частота патогенных мутаций, приводящих к сдвигу рамки считывания, из-за чего их выявление осложняется при использовании технологий секвенирования без терминирующих нуклеотидов. Примером такой технологии является технология секвенирования с протяженными прочтениями Oxford Nanopore, качество секвенирования которой за последние годы было значтельно улучшено. Однако выявление инсерций и делеций до сих пор остается проблемной областью. Целью работы стала отработка подходов к полногеномному секвенированию образцов ДНК из лейкоцитов крови пациента с 9 ранее выявленными вариациями (в том числе 1 патогенной) в генах BRCA1 и BRCA2 с помощью технологии Oxford Nanopore. ДНК была выделена стандартным фенол-хлороформным методом. Концентрация составила 91 нг/мкл, соотношения A260/A280 и A260/A230 – 1,85 и 2,29, соответственно. Все фрагменты в образце имели длину значительно превышающую 3000 п.о. Всего при секвенировании в течение 48 часов было получено 4,12 миллиона прочтений с суммарной длиной прочтений 15,8 миллиардов п.о. С помощью ROC-анализа были определены оптимальные параметры выявления точечных вариаций программой Pisces: минимально допустимое качество прочитанного основания – 6, минимальное качество варианта – 2; минимальное покрытие – 4. Важным результатом стало верное определение для исследуемого образца клинически значимой мутации в гене BRCA1 c.5266dup. Для поиска структурных вариантов была использована программа NanoVar, в которой прочтения предполагаемой перестройки прочтения снова выраниваются на референс с помощью собственного улучшенного авторами программы алгоритма blastn. Таким образом, в работе были отработаны методики выявления герминальных точечных и протяженных вариантов в ДНК, выделенной из лейкоцитов крови.

• Грант Президента МК-4082.2021.1.4 «Механизмы канцерогенеза BRCA-зависимого рака яичников», руководитель - Кечин Андрей Андреевич, 2021-2022гг., номер соглашения 075-15-2021-200.

• Кечин А.А., Боробова В.С., Субботина К.В., Боярских У.А., Тархов А.В., Филипенко М.Л. Опыт применения технологии секвенирования Oxford Nanopore для выявления герминальных мутаций // III Всероссийская конференция "Высокопроизводительное секвенирование в геномике". Тезисы. - Новосибирск: Академиздат, 2022. - С. 40.